一种利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的新方法绕过了基因中的致病突变，从而能够治疗与单个基因相关的遗传性疾病，如囊性纤维化、某些类型的镰状细胞性贫血和其他罕见疾病。宾夕法尼亚州立大学的研究人员在小鼠和人体组织培养中开发并测试了这种方法，该方法涉及插入一个新的、功能齐全的基因拷贝来取代突变基因。
4月20日发表在《分子疗法》杂志网络版上的一篇论文描述了这种方法的概念验证。
CRISPR/Cas9系统使得有希望的新基因疗法能够靶向并纠正基因中的致病突变。在这个过程中，Cas9——一种细菌蛋白——在一个特定的位置切割DNA，在DNA修复之前，基因序列可以被编辑、修剪或插入一个新的序列。然而，目前的修复策略有两个主要的限制。首先，被称为“同源定向修复”的常见修复策略需要使用细胞内仅在细胞分裂期间存在的特定蛋白质，这意味着基因修复过程不能用于大多数很少发生细胞分裂的成人组织。
CRBR利用CRISPR/Cas9系统和一种被称为“非同源末端连接”的细胞修复途径，在突变基因的启动子区域(控制基因何时何地起作用的基因序列)和基因的突变部分之间插入一个基因序列。新插入的序列包含正常基因的浓缩版本，用于取代突变版本。插入序列末端的终止序列防止剩余的下游突变基因被使用。由于CRBR不依赖于同源定向修复所需的蛋白质，因此它可以用于所有类型的成人组织。
“我们的方法选择了一个基因的原生启动子，”宾夕法尼亚州立大学的研究生、论文的第一作者胡景杰(Jingjie Hu)说。“这意味着新插入的基因将与被替换的基因同时以适当的水平在细胞内表达。与其他类型的基因疗法相比，这是一个优势，这些基因疗法依赖于外部启动子来驱动基因的高水平表达，如果产生过多或在某些生理条件下缺少必要的调节反应，可能会导致负面影响。”
研究小组进行了一系列概念验证实验，以证明该方法的实用性。他们首先关注PERK基因，这种基因的突变会导致一种名为Wolcott-Rallison综合征的罕见疾病。当从父母双方遗传的基因副本发生突变时，就会产生这种综合征——这是一种“隐性”疾病——并可能导致新生儿糖尿病、骨骼问题、生长迟缓和其他症状。
研究人员使用CRBR将PERK基因插入健康小鼠体内，并将其与基因突变的小鼠杂交。由此产生的小鼠含有一个crbr编辑的PERK基因和一个突变的PERK基因，不存在与该综合征相关的典型异常，这表明crbr编辑的基因可以挽救Wolcott-Rallison综合征小鼠模型中的PERK基因功能。
接下来，研究人员在实验室中对人体组织进行了CRBR方法的测试，在这种情况下，重点是胰岛素基因。他们在人类尸体细胞的胰岛素基因启动子和胰岛素编码序列之间插入了一个绿色荧光蛋白标记基因序列。本实验结果表明，该荧光蛋白在胰岛素分泌细胞中表达，而在其他细胞类型中未表达，这表明该新序列在胰岛素启动子的控制下受到严格调控。
胡教授说:“我们的研究结果表明，CRBR基因修复可以恢复小鼠PERK基因的功能，并揭示了CRBR在人体组织中基因修复的潜在效用。”
研究人员指出，使用CRISPR/Cas9进行基因编辑可能容易出错。例如，如果修复不能正常进行，基于同源性的修复策略可能会在编码序列中产生破坏性突变。利用CRBR，研究人员将目标对准了不编码蛋白质的基因区域内的插入，该区域应该更能容忍这些错误。
Cavener说:“像CRBR这样利用CRISPR/Cas9的基因疗法继续面临着将修复机制输送到目标细胞中的挑战。”“一项有希望的进展是，从患者身上分离出细胞或组织，在实验室修复突变基因，然后将修复的细胞或组织移植回患者体内。我们希望，随着研究人员不断改进递送方法，CRBR可以用于治疗Wolcott-Rallison综合征以及其他人类遗传疾病。”
