(羟基)肉桂醇和烯丙基酚，包括松柏醇和丁香酚，是天然存在的芳香化合物，广泛应用于制药、香料和香料中。传统上，(羟基)肉桂酸的异源生物合成(羟基)肉桂醇涉及底物的辅酶a依赖性活化。然而，最近探索的一种涉及羧酸还原酶(CAR)的替代途径已被证明在不需要辅酶a激活的情况下有效地生成(羟基)肉桂醛中间体。在这项研究中，我们研究了CAR途径在将一系列(羟基)肉桂酸转化为相应的(羟基)肉桂醇的全细胞生物转化中的应用。此外，我们试图扩展该途径，使各种烯丙酚和烯丙苯的生产成为可能。
通过筛选粗细胞裂解物中几种异源表达酶的活性，我们确定了Segniliparus rugosus CAR (SrCAR)和Medicago sativa肉桂醇脱氢酶(MsCAD2)的组合是将阿维酸两步还原为松柏醇的最有效的酶级联酶。为了优化大肠杆菌的全细胞生物转化，我们实施了一种组合方法来平衡SrCAR和MsCAD2的基因表达水平。优化后的松柏醇收率接近100%。此外，我们通过加入松柏醇酰基转移酶和丁香酚合成酶扩展了该途径，从而允许从3mm阿威酸中生产高达1.61 mM (264 mg/L)的丁香酚。这种滴度的提高超过了以前在使用辅酶a依赖的针叶树醇生物合成途径领域取得的成就。我们的研究不仅证明了CAR途径成功地利用其相应的(羟基)肉桂酸前体生物合成多种(羟基)肉桂醇，如对香豆醇、咖啡醇、肉桂醇和sinapyl醇，而且扩展了该途径以生产烯丙基酚，包括chavicol、hydroxychavicol和methoxyeugenol。值得注意的是，微生物从辛酸中生产甲氧基绿酚是一项新的成就。
SrCAR和MsCAD2酶的结合提供了一个高效的酶级联反应，用于从各自的(羟基)肉桂酸中生产各种(羟基)肉桂醇，并最终生产烯丙基酚。这扩大了微生物细胞工厂可以产生的增值分子的范围，并为制药、香精和香料等行业的应用创造了新的可能性。这些发现强调了CAR通路的多功能性，强调了其在各种生物技术应用中的潜力。
(羟基)肉桂醇和烯丙基酚是植物中常见的两个密切相关的芳香化合物。羟基肉桂醇，即松柏醇、对香豆醇和樟脑醇，是由芳香氨基酸苯丙氨酸或酪氨酸通过苯基丙氨酸途径合成的[1]。这三种羟基肉桂醇，也被称为单脂醇，在植物发育中起着至关重要的作用，是木质素和木脂素生物合成的基本组成部分。木质素对于植物细胞壁的形成和结构完整性至关重要，而木脂素参与多种植物功能，包括防御机制和生长过程的调节[2]。此外，单脂醇松柏醇和对香豆醇除了在植物生理中起关键作用外，还分别作为烯丙酚丁香酚和chavicol合成的前体。这些烯丙酚是植物精油的重要成分，为许多水果、草药和香料的独特味道和香气做出了贡献[3]。
(羟基)肉桂醇和烯丙基酚在风味和香料工业中的潜在应用[4]，以及它们作为制造生物聚合物的化学基石的适用性[5,6,7]，已经引起了人们对其微生物生物合成的越来越多的兴趣。为了在微生物宿主中从各自的(羟基)肉桂酸前体生成(羟基)肉桂醇，大多数研究采用了植物中常见的苯丙醇途径。该途径涉及一系列酶促反应[1]。首先，(羟基)肉桂酸底物通过4-香豆酸辅酶a连接酶的作用被激活。这种激活导致(羟基)肉桂酰辅酶a的形成，作为中间体(图1)。随后，肉桂酰辅酶a还原酶催化(羟基)肉桂酰辅酶a的还原，导致(羟基)肉桂醛的形成。为了完成(羟基)肉桂醇的合成，将醛进一步还原为所需的醇形式。这一还原步骤可以通过内源性醇脱氢酶或将异源表达的醇脱氢酶引入微生物宿主来促进[8,9,10,11,12,13]。在大肠杆菌中，通过辅酶a依赖途径补充阿魏酸获得的针叶树醇的产率范围相当大，从4-91%不等[8,9,10,11,13]。最近，研究人员研究了一种替代途径，可以将(羟基)肉桂酸直接还原为相应的(羟基)肉桂基醛[14,15]。该途径涉及使用羧酸还原酶(CAR)，消除了对底物辅酶a依赖性激活的需要(图1)。通过使用由诺卡迪亚诺瓦氏菌CAR和黄蚁醛酮还原酶组成的酶级联，在优化的生长条件下，松柏醇的产率达到97%[15]。
羟基肉桂醇可通过两个酶促步骤生成烯丙基酚(图1)。首先，羟基肉桂醇通过酰基转移酶乙酰化[16]。随后，生成的羟基肉桂乙酸酯被还原成烯丙基酚[17]。Robinson等人采用由矮牵牛花松柏醇酰基转移酶(PhCFAT)和罗勒麝香丁香酚合成酶(ObEGS)与辅酶a依赖的羟基肉桂醇生物合成途径相结合的途径，分别从阿威酸和对香豆酸生产丁香酚和chavicol[10]。然而，得到的丁香酚和chavicol的滴度相对较低，分别为102 mg/L和28 mg/L，并且大量底物仍未转化[10]。此外，Chen等人[8]开发的辅酶a依赖途径最近与PhCFAT和矮牵牛花EGS在细菌共培养系统中结合使用，导致阿魏酸产生高达244mg /L的丁香酚[13]。其他研究报道了通过过表达ObEGS在重组草莓中的生物合成烯丙基酚[18]，或在大肠杆菌中表达来自Larrea tridentata的肉桂醇酰基转移酶和丙烯酚合成酶，并在细菌培养中添加各自的羟基肉桂醇前体[19]。
在这项研究中，我们展示了利用CAR酶介导的全细胞生物转化方法成功地将羟基肉桂酸转化为烯丙基酚。首先，我们在体外鉴定出效果最好的酶候选物是Segniliparus rugosus CAR和Medicago sativa肉桂醇脱氢酶。接下来，我们通过组合方法优化它们的表达水平。这使得各种(羟基)肉桂醇在体内有效的生物合成，实现阿魏酸几乎完全转化为松柏醇。随后，通过使用PhCFAT和ObEGS扩展该途径，我们证明了在大肠杆菌中从各自的羟基肉桂酸前体生产丁香酚、chavicol、羟基chavicol和甲氧基丁香酚(图1)。得到的滴度范围为0.15至0.26 g/L。这些发现强调了使用混杂的基于car的微生物生产烯丙酚途径作为植物提取方法的可行替代方法的可行性。
图1
烯丙基酚和烯丙基苯的生物合成途径，涉及辅酶a依赖性激活(橙色)或羧酸还原酶介导的(羟基)肉桂酸底物还原(紫色)。酶缩写:4CL, 4-香豆酸辅酶a连接酶;CCR，肉桂酰辅酶a还原酶;CAR:羧酸还原酶;CAD，肉桂醇脱氢酶;松柏醇酰基转移酶;丁香酚合成酶
为了建立将阿魏酸转化为丁香酚的生物合成途径，而不需要辅酶a依赖的底物激活，我们首先寻求能够催化阿魏酸双重还原为松柏醇的酶的最佳组合(图1)。为此，我们使用两种羧酸还原酶(CAR)、两种醇脱氢酶和一种醛酮还原酶(AKR)进行酶活性筛选试验。
在Tramontina等人最近的一项研究中，作者评估了5种car还原阿威酸的能力，并鉴定出来自诺卡菌(Nocardia iowensis, NiCAR)和rugosus Segniliparus rugosus (SrCAR)的car是表现最好的候选酶[15]。在他们的工作中，最终选择NiCAR与Coptotermes gestroi AKR-1 (CgAKR-1)一起催化阿威酸在体外和体内转化为针叶树醇[15]。在本研究中，我们将假单胞菌属菌株HR199松叶树醇脱氢酶(PsCalA)和紫花苜蓿肉桂醇脱氢酶(MsCAD2)与CgAKR-1一起进行活性筛选。这些酶先前已被证明可以有效地将各种(羟基)肉桂基醛还原为相应的醇[10,20]。
首先，我们使用表达NiCAR或SrCAR的大肠杆菌NEB5α的全细胞裂解物监测阿魏酸转化为针叶树醛的情况。这些CARs分别与枯草芽孢杆菌4′-磷酸蚁甲酰基转移酶(Sfp)共表达，Sfp是激活CAR所必需的酶[21]。在两种测试酶中，SrCAR表现出比NiCAR更高的活性，在3小时的孵育期后产生28.2%的产物收率(表1)。这一发现与Tramontina等人的观察结果形成对比，他们在分析中报告了更高的NiCAR收率[15]。然而，值得注意的是，他们的测定采用纯化酶而不是全细胞裂解物进行活性筛选。除了针叶树醛外，我们还观察到低水平的针叶树醇生成，这可归因于大肠杆菌NEB5α全细胞裂解液中存在的内源性醛酮还原酶和醇脱氢酶[22]。3种酶催化松柏醛制松柏醇的效果最好，MsCAD2的产率为19.3%，其次是PsCAD和CgAKR1，产率分别为14.5%和4.5%。
接下来，我们研究了通过结合含有单个酶的细胞裂解物将阿魏酸双重还原为针叶树醇。SrCAR与MsCAD2结合的两步反应效率最高，产物收率为50.3%(表1)。由NiCAR和MsCAD2组成的酶联反应的转化率次之，产物收率为33.6%。这些结果与之前的观察结果一致，即NiCAR和SrCAR在使用纯化酶作为催化剂的体外筛选中表现相似[15]。基于它们在全细胞裂解物活性筛选中的表现，我们选择了SrCAR和MsCAD2来评估阿魏酸在体内转化为松叶醇的能力。
表1 .全细胞裂解物活性筛选大肠杆菌NEB5α表达两个步骤co的单个酶阿魏酸转化为钴硝基醇通过coniferyl醛
在选择合适的酶之后，我们设计并构建了阿魏酸在大肠杆菌NEB5α体内全细胞生物转化为针叶树醇的生物合成途径。为了确定基因表达水平的最佳平衡，我们采用了组合途径设计方法，该方法已成功用于精细化学品的微生物生产[23]。为了控制每个通路基因的表达水平，我们考虑了三个参数:启动子的强度、在通路中的位置和复制的质粒起源(图2A)。为了创建质粒组合文库，我们使用了两个iptg诱导的可变强度启动子(Ptrc和PlacUV5)，以及两个不同的复制起点(中等拷贝数，p15A;高拷贝数ColE1)[24]。基因间区可能包含两个启动子中的任何一个，也可能根本不包含，基因可能占据通路中的任何位置。总共使用三个基因- SrCAR, Sfp和MsCAD2 -可以产生216种可能的组合。采用实验设计(design of experiments, DoE)的方法，统计上将大量潜在的路径设计减少到9个具有代表性的路径设计，覆盖整个设计空间(图2B)[23]。将这9个途径变体组装并导入大肠杆菌NEB5α。随后，向细胞中添加阿威酸，并监测48小时松柏醛和松柏醇的生物合成情况。在测试的途径中，表现最好的设计(SBC015866)在20小时内从3 mM阿威酸中产生2.99 mM松柏醇(538 mg/L)(图2B)。该滴度表明底物几乎完全转化为所需的产物。第二好的途径SBC015869产生2.64 mM松柏醇。值得注意的是，未诱导和诱导培养之间的产物滴度差异很小，最大百分比差异为34% (SBC015867)。这不仅表明诱导启动子有相当程度的泄漏表达，而且表明即使没有添加诱导剂IPTG，基因表达水平也已经相当平衡。在所有9种途径变体中均检测到针叶树醛，但仅在针叶树醇滴度低于1%的水平，表明通过两步途径的有效通量。
值得注意的是，针叶树醇滴度在20-24小时达到最大产量后下降了50%(附加文件1:图S1)。先前在大肠杆菌中观察到针叶树醇和咖啡因醇滴度的下降，假设是由于产品消耗或挥发性[8,9]。为了确定原因，我们在24小时内监测了在存在和不存在大肠杆菌NEB5α细胞的培养基中添加松柏醇的滴度。在没有细胞的培养基中，松柏醇的水平保持不变，而在含有大肠杆菌NEB5α的培养基中，滴度随着时间的推移而下降(附加文件1:图S2)。这一发现表明，松柏醇滴度的下降是细胞代谢而不是挥发的结果。事实上，我们观察到含有大肠杆菌NEB5α的培养物中针叶树醛的积累，表明内源性乙醇脱氢酶可能催化了针叶树醇的氧化。
由于SBC015866在体内几乎完全将阿魏酸转化为针叶树醇，因此没有进一步优化途径。利用由SrCAR和MsCAD2组成的酶级联在优化基因表达水平后获得的产率与之前使用NiCAR与CgAKR1联合获得的97%的产率相当[15]。然而，它超过了已报道的阿魏酸通过阿魏酰辅酶a生物转化为松柏醇的产率，产率从4-91%不等[8,9,10,11,13]。
图2
松柏醇生物合成途径的组合优化。A阿魏酸转化为松柏醇的途径涉及三个基因——SrCAR、Sfp和MsCAD2。设计了一个组合的质粒文库来编码这一途径，其中包括复制的起源、途径基因的顺序和启动子部分的变化。B途径变异体在体内产生松柏醇的测试。携带单个质粒的大肠杆菌NEB5α在添加0.4%甘油和3mm阿魏酸的TBP培养基中，30℃培养20 h。误差条表示三个生物重复的标准差。细胞在IPTG不存在(?)和存在(+)的情况下生长
丁香酚是一种挥发性芳香化合物，因其辛辣和丁香般的香气而广泛应用于香精和香料行业[25]。它可以通过两步得到，首先是针叶醇乙酰化，然后是针叶醇乙酸酯还原生成丁香酚(图1)。先前已经开发了一种优化的针叶醇生产丁香酚的途径(SBC009876)[10]。它由矮牵牛松柏醇酰基转移酶(PhCFAT)和罗勒丁香酚合成酶(ObEGS)组成。携带该途径的大肠杆菌DH5α ΔtyrR ΔpheLA在添加3 mM松柏醇时产生0.17 mM丁香酚[10]。
考虑到在我们的组合质粒库筛选中获得的出色转化率，我们试图结合两种途径来确定从阿魏酸中可以获得多少丁香酚。将含有丁香酚生物合成途径的质粒(SBC009876)与含有松柏醇生物合成途径的三种质粒中的一种结合转化大肠杆菌NEB5α(图3A)。我们选择SBC015866和SBC015869以及SBC015863这两个表现最好的通路变体进行比较。在摇瓶中培养菌株，并在72小时内监测丁香酚的产量。可以观察到丁香酚的生产趋势与松柏醇的生产趋势相似(图3B)。两个表现最好的松柏醇生物合成途径候选物也产生了最多的丁香酚。携带SBC015866的菌株丁香酚滴度最高，为1.61 mM (264 mg/L)。与组合质粒文库筛选结果相似，携带SBC009876的菌株与SBC015866或SBC015869的菌株完全消耗阿威酸，而大肠杆菌NEB5α SBC009876 SBC015863中仍有25%的底物未转化。在所有菌株中均未检出针叶醛和针叶醇。
与之前利用SBC009876结合辅酶a依赖性松柏醇生物合成途径实现的102 mg/L的生产水平相比，264mg /L的丁香酚生产水平有了显著提高[10]。这证明了丁香酚生产效率的显著提高，突出了car依赖途径的潜力。
此外，为了验证在更大规模和更适合工业工艺的培养基中生产丁香酚，我们使用0.25 L的生物反应器，在添加0.4%甘油和3 mM阿魏酸的葡萄糖最低培养基中，对表现最佳的菌株E. coli NEB5α SBC015866 SBC009876进行了补料分批发酵。接种72 h后，我们获得了0.51 mM (83 mg/L)的最大丁香酚滴度，比24 h后的0.49 mM (80 mg/L)略有增加。值得注意的是，由于在24小时时间点向培养中添加了IPTG来诱导途径表达，这表明即使在没有诱导剂的情况下，丁香酚生物合成途径也已经充分表达。类似于在组合质粒库筛选中观察到的松柏醇产量(图2B)。这一发现与初始批处理阶段后生长速率的下降相一致，如CO2产率所示(附加文件1:图S3)，表明生长抑制代谢物的积累。虽然83 mg/L的最大丁香酚滴度明显低于摇瓶中达到的滴度，但优化工艺参数，包括培养基成分和葡萄糖饲养，以及在培养过程中去除产物，有可能进一步大规模提高丁香酚的产量。
图3
利用car依赖途径将阿魏酸转化为丁香酚。丁香酚生物合成途径分为两个模块。第一个模块由SrCAR和MsCAD2酶组成，催化阿威酸的两步还原，从而形成松柏醇。第二个模块包括PhCFAT和ObEGS酶，催化两步将松柏醇转化为丁香酚。B携带SBC009876的大肠杆菌NEB5α与三种指定质粒中的一种结合产生丁香酚。在时间点0，细胞补充3 mM阿魏酸，并通过添加IPTG诱导通路酶的表达。误差条表示生物重复体的标准偏差
本研究中使用的酶在苯丙代谢中具有广泛的底物接受性。除了SrCAR和MsCAD2可以分别转化各种(羟基)肉桂酸和(羟基)肉桂醛外，用于两步转化松叶醇为丁香酚的酶也表现出广泛的底物耐受性。例如，PhCFAT可使多种(羟基)肉桂醇乙酰化，包括肉桂醇、对香豆醇或樟脑醇[16]。同样，ObEGS也被用于体内还原对香豆醇醋酸酯[10]和体外将乙酸sinapyl转化为甲氧基绿酚[18]。鉴于这些酶的混杂性，我们试图利用car依赖途径将一系列(羟基)肉桂酸转化为相应的(羟基)肉桂醇，随后转化为烯丙基酚和烯丙基苯。除了丁香酚的生物合成，我们还研究了对香豆酸、咖啡酸、肉桂酸和辛酸分别转化为chavicol、hydroxychavicol、烯丙基苯和甲氧基丁香酚。
对于每种底物，我们首先进行组合质粒库筛选，以确定将(羟基)肉桂酸转化为各自(羟基)肉桂醇的最佳途径变体。随后，将这些候选途径中的两个或三个与将(羟基)肉桂醇转化为烯丙基酚的途径(SBC009876)结合起来，就像生产丁香酚一样。采用大肠杆菌NEB5α菌株进行对香豆酸、咖啡酸和辛酸的生物转化，而不能分解肉桂酸的大肠杆菌NEB5α ΔhcaE菌株进行生物转化[26]。携带9个途径变体的大肠杆菌NEB5α或大肠杆菌NEB5α ΔhcaE补充3 mM(羟基)肉桂酸，并监测(羟基)肉桂醇的生物合成长达48小时。
所有四种底物都成功转化为各自的醇，最大产物滴度为2.71 mM对香豆醇、0.87 mM咖啡醇、0.7 mM肉桂醇和2.33 mM新树醇(表2)。在对香豆醇和肉桂醇的情况下，分别在16和24 h后，在任何菌株中都没有检测到残留的底物(附加文件1:图S4和S5)。然而，对于咖啡因醇和新萘酚，一些途径变体的底物水平仍未转化，而其他途径变体的转化效率更高(附加文件1:图S6和S7)。在候选途径中，SBC015866表现出最有效的底物消耗，培养基中只剩下残留的咖啡酸和辛酸。不同途径变体之间转化效率的差异也反映在羟基肉桂醛中间体的积累上。对于对香豆醇，某些途径变体显示出显著水平的对香豆醛，达到0.98 mM，而途径候选SBC015866保持较低水平的对香豆醛(附加文件1:图S4)。
与针叶树醇的观察结果相似，对香豆醇和新颖醇的滴度随着时间的推移而下降(附加文件1:图S4和S7)。对所有四种(羟基)肉桂醇进行了饲养实验，结果显示，随着时间的推移，将其饲喂于培养基中生长的大肠杆菌NEB5α(附加文件1:图S8)。值得注意的是，即使在没有细胞的情况下，培养基中咖啡因醇和新萘醇的滴度也会下降，这表明这些化合物在培养基中具有一定的不稳定性(附加文件1:图S8)。有趣的是，在松柏醇、对香豆醇、咖啡醇和新萘醇的培养基中，观察到细胞的颜色变化，从黄色(对香豆醇)到红色(新萘醇)和棕色(咖啡醇)(附加文件1:图S9)。据报道，在过氧化物酶介导的氧化二聚和聚合过程中，松柏醇和sinapyl醛也发生了类似的颜色变化[27]，这表明内源性醇脱氢酶和过氧化物酶参与了大肠杆菌NEB5α中(羟基)肉桂醇的代谢。尽管如此，尽管它们的代谢，组合质粒库筛选成功地确定了每种(羟基)肉桂醇的最佳候选途径(表2)。
正如阿威酸生物合成丁香酚的研究中所示，PhCFAT和ObEGS(由质粒SBC009876编码)扩展了(羟基)肉桂醇生物合成途径，使得从各自的羟基肉桂酸前体中生产出chavicol、hydroxychavicol和methoxyeugenol(表2)。chavicol的滴度为223 mg/L，大大超过了之前报道的28 mg/L滴度。这是通过辅酶a依赖途径将对香豆酸转化为对香豆醇实现的[10]。此外，通过从对香豆酸开始的四步代谢途径获得的chavicol滴度也明显高于之前通过向仅表达PhCFAT和ObEGS的菌株输入3 mM对香豆醇而获得的168 mg/L的滴度，这两步催化了最后两步[10]。这一发现可归因于细胞内产生的对香豆醇的快速加工，而不是细胞外补充的对香豆醇的摄取和转化。据我们所知，这是第一次在微生物宿主中由辛酸生产甲氧基绿酚，滴度为148 mg/L。除咖啡酸在18小时内被完全消耗(附加文件1:图S10)外，表现最好的菌株未转化的对香豆酸和辛酸不到10%(附加文件1:图S11和S12)。此外，在携带SBC015866或SBC015869的菌株中未检测到任何烯丙酚的羟基肉桂醇中间体(附加文件1:图S10、S11和S12)，表明PhCFAT在体内有效地将其加工成各自的羟基肉桂酸酯。此外，一旦达到最大产量，烯丙酚滴度保持不变，突出了快速处理羟基肉桂醇中间体以避免产品收率下降的重要性。
相比之下，在携带SBC009876的大肠杆菌NEB5α ΔhcaE中，当与三种产肉桂醇途径(SBC015866、SBC015869或SBC015871)联合以及添加肉桂酸时，均检测不到烯丙基苯。然而，在这三种菌株中，我们观察到基于GC-MS/MS碎片模式的与肉桂酰乙酸相匹配的化合物的大量积累(附加文件1:图S13)。这表明，虽然肉桂酸在体内转化为肉桂乙酸酯，但在本研究测试的条件下，ObEGS无法将其进一步还原为烯丙基苯。
表2(羟基)肉桂醇和烯丙基酚在本研究中获得的滴度。指出了获得滴度的途径和样品时间点。(?/+)表示是否添加了IPTG。滴度代表生物三倍的平均值
摘要。
背景
结果与讨论
结论
材料与方法
数据可用性
参考文献。
致谢。
作者信息
道德声明
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在这项研究中，我们开发了一种优化的途径，使各种(羟基)肉桂酸在体内生物转化为各自的(羟基)肉桂醇。通过扩展这一途径，我们成功地生产了烯基酚丁香酚、chavicol、羟基chavicol和甲氧基丁香酚。我们的丁香酚和chavicol的生产超过了先前报道的使用辅酶a依赖途径激活(羟基)肉桂酸的效价，而从辛酸生物合成甲氧基丁香酚代表了一项新的成就。重要的是，我们观察到大肠杆菌NEB5α在很大程度上代谢了所有(羟基)肉桂醇，强调需要优化底盘菌株和有效的烯丙基酚生物合成途径，以最大限度地减少潜在副产物的积累。我们相信car依赖通路在(羟基)肉桂醇和其他相关烯丙基酚的生产中具有广泛的潜力。
RetroPath2.0[28]被用于创建阿魏酸生产丁香酚的潜在生物合成途径(附加文件1:图S14)。为了验证途径结果，将反应与现有文献进行交叉对照。在生成的途径中，根据其长度、简单性和新颖性，最终选择了通过松柏醛、松柏醇和松柏乙酸酯依次将阿魏酸转化为丁香酚的途径。选择途径后，使用Selenzyme[29]为所提出的途径中的每个反应生成候选酶列表。最终候选名单是根据文献证据确定的，证明酶在大肠杆菌中成功表达和活性。在没有列出理想的候选酶的情况下，在进行手动文献检索后建议替代选项。
利用新英格兰生物实验室(NEB)的5α活性大肠杆菌进行克隆、质粒繁殖，合成松柏醇、丁香酚、对香豆醇、沙维醇、咖啡醇、羟基沙维醇、辛纳醇和甲氧基绿酚。利用大肠杆菌NEB5α ΔhcaE菌株生产肉桂醇和烯丙苯。本研究中使用和产生的所有菌株列于附加文件1:Table S1。细菌细胞常规在Luria-Bertani (LB)培养基中培养[30]。在添加0.4% (w/v)甘油的磷酸盐缓冲的Terrific Broth (TBP, Formedium)中进行(羟基)肉桂酸到相应的(羟基)肉桂醇、烯丙基酚和烯丙基苯的体内生物转化，以及(羟基)肉桂醇在细胞存在或不存在的情况下的化学稳定性评估。根据需要，在培养基中加入以下浓度的抗生素:100μg/mL卡霉素、34μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素。
质粒DNA提取采用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)。使用NEB公司的Q5 High-Fidelity 2X Master Mix在50μL反应中扩增待克隆的DNA。使用Zymoclean凝胶DNA恢复试剂盒(Zymo Research)提取凝胶纯化的线性化DNA。NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix和限制性内切酶从NEB购买。使用oneTaq PCR Master Mix (2X, NEB)在25μL反应中筛选细菌菌落以确认hcaE基因的染色体缺失。所有PCR-， HiFi-和消化反应都按照制造商的说明进行。制备了具有化学活性的大肠杆菌，并通过热休克进行转化[30]。
寡核苷酸引物由Integrated DNA Technologies (IDT)合成，列于附加文件1:Table S2。基因部分使用PartsGenie设计，RBS翻译起始率设置为20,000[31]，由TWIST Bioscience定制合成并克隆到基于pbbe2c的表达质粒中[24]。质粒由HiFi DNA Assembly构建，每个质粒的组成部分的详细摘要见附加文件1:表S3。通过Sanger测序(Eurofins Genomics)验证了质粒的正确组装。本研究中使用和生成的所有质粒列于附加文件1:Table S4。质粒SBC015863-SBC015871的核苷酸序列已分别以ACS_000886-ACS_000894的登录号存入ACS注册库(https://acs-registry.jbei.org)的公开版本。
大肠杆菌NEB5α hcaE缺失菌株采用先前报道的基于crispr的基因编辑技术构建[32]。为了构建目标特异性载体pTF-hcaE, hcaE基因首先筛选序列为TTTV的Cas12a原间隔器邻近基序(PAMs)。然后使用CRISPR AsCpf1插入和删除评分网络工具[33]对PAM和原间隔序列的27bp候选序列进行评价，选择评分最高的候选序列构建pTF-hcaE。供体DNA包含50 bp同源臂，设计用于删除hcaE基因3 '端除起始密码子和最后7个密码子外的所有密码子[32]。利用重组位点两侧的引物EHseq049和EHseq050，通过集落PCR证实hcaE缺失。
酶活性筛选试验按照先前的方案[10]进行，并进行了一些修改。CAR和CAD酶直接从各自基于pbbe2c的表达质粒上表达，该表达质粒由TWIST Bioscience按照报道的方案构建[10]。Sfp由pCDF1b_Sfp质粒表达[14]。含有特定酶的粗裂解物直接用于以下检测:CAR检测中含有CAR和Sfp的总蛋白粗裂解物为100μg, CAD/AKR检测中含有CAD/AKR的总蛋白粗裂解物为25μg，级联检测中含有CAR和Sfp的总蛋白粗裂解物为250μg，含有CAD/AKR的总蛋白粗裂解物为100μg。对于CAR实验，反应缓冲液由100 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM ATP、10 mM MgCl2、3 mM NADPH和3 mM阿威酸组成，反应体积为1 ml。在CAD/AKR实验中，反应缓冲液中含有50mm磷酸盐缓冲盐水(pH 7.0)， 0.2 mM NADPH和5mm松柏醛，反应体积为1ml。级联实验缓冲液与CAR/AKR实验缓冲液相同，但NADPH浓度更高，为6 mM。所有实验均在2 ml管中，30℃，250 rpm摇培养3 h，然后取样并使用LC-MS/MS测量产物滴度。
为了评估不同(羟基)肉桂醇在无细胞培养基中的稳定性，将每种醇分别添加到1 mL TBP培养基中，置于96-deepwell plate (DWP)中，最终浓度为2 mM。然后用透气密封密封板，在30℃，80%湿度下，850 rpm下摇轨孵育。加入后立即采集样品，6和24 h后采集样品。
为了确定不同(羟基)肉桂醇在含细胞培养基中的稳定性，用大肠杆菌NEB5α单菌落接种于96-DWP中添加甘油(0.4% w/v)的TBP培养基1 mL。用透气密封板密封，30℃，80%湿度，850转/分摇轨孵育16-18 h，培养种子。在1ml新鲜TBP培养基中加入甘油(0.4% w/v)和各自的(羟基)肉桂醇，将种子培养物稀释至OD600nm为0.2，最终浓度为2mm，建立主培养物。立即收集样品，并在6和24小时后收集样品。对于两个实验，(羟基)肉桂醇滴度均使用HPLC-或UPLC-DAD进行定量，具体取决于所分析的具体目标。
大肠杆菌NEB5α SBC015866 SBC009876在0.25 L生物反应器(DASbox?Mini bioreactor System, Eppendorf)中进行补料分批发酵。发酵培养基为17.5 g/kg葡萄糖、6 g/kg KH2PO4、5 g/kg (NH4)2SO4、2 g/kg NaCl、3 g/kg柠檬酸钠、6 g/kg MgSO4 × 7H2O、0.03 g/kg CaCl2、0.15 g/kg硫胺素HCl、0.0225 g/kg FeSO4 × 7H2O、0.5 g/kg酵母膏和3 g/kg微量元素溶液[34]。另外，培养基中添加0.4%甘油、3mm阿魏酸、50mg /L卡那霉素和34mg /L氯霉素。用10%的NH4OH维持pH为7.0，温度为37℃。通过调节搅拌速率，使溶解氧浓度保持在40%，气体流速保持在1 vvm。在生物反应器中接种2%的生物质，这些生物质来自摇瓶中培养的种子，初始葡萄糖在批量发酵中消耗。一旦CO2信号下降，pH值增加到7.15，就开始添加含有55% (w/w)葡萄糖的饲料。以0.1 h?1的指数速率增加进料速率，直至氧传递速率达到180 mmol/kg/h。随后，保持恒定的进料速率。接种24 h后，加入终浓度为0.1 mM的IPTG诱导培养。
为了生物合成(羟基)肉桂醇、烯丙基酚和烯丙基苯，用新转化的细胞单菌落接种1 mL添加了甘油(0.4% w/v)和适当抗生素的TBP培养基，96-DWP，用透气密封密封。30℃，80%湿度，850转/分摇轨孵育16-18 h。
为生产(羟基)肉桂醇或烯丙基苯，分别在1 mL或1.2 mL新鲜TBP培养基中添加甘油(0.4% w/v)和96-DWPs的相关抗生素，将种子培养液稀释至OD600nm为0.02，建立主培养物。这些主要培养物被送回摇床培养箱。对于(羟基)肉桂醇的生物合成，每个种子培养都建立了两个主要培养:一个不诱导，另一个最终添加异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)。
为了生产丁香酚、chavicol、羟基chavicol和甲氧基丁香酚，将种子培养物在50 mL新鲜TBP培养基中添加甘油(0.4% w/v)和相关抗生素，在250 mL无折流摇瓶中稀释至OD600nm=0.02制备主培养物。这些培养物在30℃和180 rpm下孵育。
为了生成(羟基)肉桂醇、烯丙基酚和烯丙基苯，当培养的OD600nm为1.0-1.5时，(羟基)肉桂酸和可选的IPTG分别添加到最终浓度为3 mM和100μM。除烯丙苯外，将培养物送回各自的摇床培养箱中，培养72小时。
对于烯丙苯的生物合成，添加肉桂酸和IPTG后，将1ml培养物转移到20ml顶空瓶中。用0.5 mL 2,2,4-三甲基戊烷(TMP)和仲丁基苯(Sigma)复盖培养液，终浓度为0.005% (v/v)。用气密螺旋盖密封，30℃，180转/分孵育24 h。
为了定量(羟基)肉桂醇、烯丙基酚和烯丙基苯及其前体和中间化合物，采用了不同的方法和仪器。使用HPLC-DAD、UPLC-DAD和LC-MS/MS进行复合定量时，通过加入等体积的100%甲醇来冷却培养样品，然后在16000 g下涡流离心10分钟。对于HPLC-DAD和UPLC-DAD分析，无细胞上清液稀释10倍，而对于LC-MS/MS分析，细胞无上清液使用甲醇/水(10:90 v/v)稀释1000倍。为了使用GC-MS/MS定量烯丙苯，将有机层转移到2 ml的Eppendorf管中，在16000 g离心10分钟。然后用TMP稀释5倍，与无水Na2SO4涡流去除残余水，并转移到GC小瓶中进行分析。用TMP稀释样品，加入0.005%的仲丁苯作为内标。代谢物浓度由已知浓度的标准物生成的校准曲线测定，以与样品相同的方式制备。定量方法和用于每种目标化合物的仪器的摘要可在附加文件1的补充方法中找到。
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